小球藻接種前，所用的液體培養基和容器于1.2 kg·cm-2壓力下蒸汽滅菌20min。從保存藻種的平板上挑取小球藻，培養于裝有5 mL BBMG液體培養基的試管中。弱光下培養5-7 d，再將試管種接入50 mLBBMG 液體培養基，于弱光下培養至對數期，此為最初的液體種子。培養小球藻時，接入2% 的液體種子于50 mL 培養液中，放在搖床上于25℃弱光下培養，搖床轉速為120 r·min-1，4-5 d 即可得到實驗用的小球藻。

③、預處理液的加入

在室溫下分別取2 mL藻液置于若干離心管中離心(轉速500 r·min-1，下同)，棄去上清液，小球藻沉降于離心管底部，然后分別加入預先配制的預處理液（預處理液為0.5 mol·L-1甘油和0.4 mol·L-1 蔗糖的組合），混勻，于室溫下處理20 min 后再離心。

④、玻璃化液處理

玻璃化液配方為30% 蔗糖+15％乙二醇+ 10%二甲基亞砜+ BBMG 培養液，加入前先放在0-4℃下預冷，在無菌條件下取代預處理液，懸浮后移入凍存管，于0 ℃下預凍60 min后放入液氮中保存。

⑤、化凍和玻璃化保護劑的去除

將在液氮中保存的凍存管取出，立刻放入40℃恒溫水浴中迅速搖動，直到最后一個冰晶消失后移入室溫中?；瘍龊蟮男∏蛟逶跓o菌條件下先在0.4 mol·L-1的蔗糖溶液中室溫平衡5 min，然后再在1.2 mol·L-1蔗糖溶液中平衡5 min，最后轉入BBMG 液體培養基中培養。培養條件為27℃、弱光、搖床速度120 r·min-1，培養4 d。

㈡、固定化保存法

①、固定化膠球的制備

將2.5ml注射器，4%的海藻酸鈉（溶解液）與培養至對數生長期的藻種液按一定的比例(可以用同等比例）混合均勻，將混合液滴入盛有0.1mol/L氯化鈣溶液的三角燒瓶中。邊滴邊搖動。靜止15分鐘后。將形成海藻酸鈣——細胞固定化膠球。

②、保存

將上述膠球用鋁箔紙包裹密封在三角燒瓶內。不添加任何培養液，保存在黑暗中，置于4°C的冰箱中保存。最長可保存一年。

③、測再生能力

保存15天后，取膠球，用無菌去離子水清洗三次。移入150ml三角燒瓶內,并加入50ml培養液培養.往膠球中加入一定體積的0.1mol/L的檸檬酸鈉溶液溶解膠球。測再生能力。

8．存活率的測定

將經過處理的小球藻樣品和對照小球藻樣品再培養4 d 后，用722 型光柵分光光度計于波長540 nm 處測藻液的吸光度。根據預先確定的藻細胞密度(y×108個·L-1)和吸光度(x)的直線回歸方程：y=3.456x-0.389(r=0.9961)，可以推算出上述冰凍樣品和對照樣品在再培養4 d 后的藻細胞密度，兩者的百分比值即為超低溫保存的存活率。實驗重復3 次，每處理設置3 個平行樣品，取平均值。

本文來源:海南招聘網

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